隨著(zhù)現代醫學(xué)及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各學(xué)科相互交叉和滲透，醫學(xué)微生物學(xué)檢驗技術(shù)已深入到細胞、分子和基因水平，許多新技術(shù)、新方法已在臨床微生物實(shí)驗室得到廣泛應用。醫學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗室的基本任務(wù)之一是利用微生物學(xué)檢驗技術(shù)，準確、快速檢驗和鑒定臨床標本中的微生物，并對引起感染的微生物進(jìn)行耐藥性監測，為臨床對感染性疾病診斷、治療、流行病學(xué)調查及研究等提供科學(xué)依據。

微生物形態(tài)學(xué)檢查

  細菌形態(tài)學(xué)檢查是細菌檢驗的重要方法之一，它是細菌分類(lèi)和鑒定的基礎，可根據其形態(tài)、結構和染色反應性等，為進(jìn)一步鑒定提供參考依據。

一、顯微鏡檢查

  由于細菌個(gè)體微小，肉眼不能看到，必須借助顯微鏡的放大才能看到。一般形態(tài)和結構可用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，其內部的超微結構則需用電子顯微鏡才能看清楚。常用顯微鏡有如下幾種。

1.普通光學(xué)顯微鏡

  采用自然光或燈光為光源，其波長(cháng)約為0.4μm。顯微鏡的分辨率為波長(cháng)的二分之一，即0.2μm，而肉眼可見(jiàn)的最小形象為0.2mm。故用油(浸)鏡放大1 000倍，能將0.2μm的微粒放大成肉眼可見(jiàn)的0.2mm。普通光學(xué)顯微鏡可用于細菌、放線(xiàn)菌和真菌等的觀(guān)察。

2.暗視野顯微鏡

  常用于觀(guān)察不染色微生物形態(tài)和運動(dòng)。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線(xiàn)不能從中間直接透入，視野呈暗色，當標本接受從聚光器邊緣斜射光后可發(fā)生散射，因此可在暗視野背景下觀(guān)察到光亮的微生物如細菌或螺旋體等。

3.相差顯微鏡

  相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉換為光強度差。在相差顯微鏡下，當光線(xiàn)透過(guò)不染色標本時(shí)，由于標本不同部位的密度不一致而引起光相的差異，可觀(guān)察到微生物形態(tài)、內部結構和運動(dòng)方式等。

4.熒光顯微鏡

  熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡基本相同，主要區別在于光源、濾光片和聚光器。目前大多數使用的是落射光裝置，常用高壓汞燈作為光源，可發(fā)出紫外光或藍紫光。濾光片有激發(fā)濾光片和吸收濾光片二種。用藍光的熒光顯微鏡除可用一般明視野聚光器外，也可用暗視野聚光器，以加強熒光與背景的對比。本法適用于對熒光色素染色或與熒光抗體結合的細菌的檢測或鑒定。

5.電子顯微鏡

  用電子流作為光源，波長(cháng)與可見(jiàn)光相比差幾萬(wàn)倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作為光學(xué)放大系統，放大倍數可達數萬(wàn)倍或幾十萬(wàn)倍，常用于病毒顆粒和細菌超微結構的觀(guān)察。

二、不染色標本檢查

  不染色標本一般可用于觀(guān)察細菌形態(tài)、動(dòng)力及運動(dòng)情況。細菌未染色時(shí)無(wú)色透明，在顯微鏡下主要靠細菌的折光率與周?chē)h(huán)境的不同來(lái)進(jìn)行觀(guān)察。有鞭毛的細菌運動(dòng)活潑，無(wú)鞭毛的細菌則呈不規則布朗運動(dòng)。梅毒蒼白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有特征鮮明的形態(tài)和運動(dòng)方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細管法等。

1.懸滴法

  在潔凈凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹玻片的凹孔對準蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣的凡士林粘緊封閉后置高倍鏡下(或暗視野)觀(guān)察。

2.壓滴法

  用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液置于潔凈玻片的中央，在菌懸液上輕輕蓋上一蓋玻片，注意避免產(chǎn)生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數秒鐘后置高倍鏡下明視野(或暗視野)觀(guān)察。

3.毛細管法

三、染色標本檢查

  細菌標本經(jīng)染色后，由于細菌與周?chē)h(huán)境間在顏色上形成鮮明對比，故在普通光學(xué)顯微鏡下可清楚地觀(guān)察到細菌的形態(tài)特征(如細菌的大小、形狀、排列等)和某些特殊結構(如莢膜、鞭毛、芽孢等)，并可根據染色反應性對細菌加以分類(lèi)鑒定。

(一)細菌染色的一般程序

  細菌染色的一般程序是：涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脫色)—(復染)。

1.涂片制備

  血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養物，直接在載玻片上作薄膜涂片;尸檢或感染動(dòng)物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置載玻片中央，再用無(wú)菌接種環(huán)取少量的培養物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠火慢慢烘干。

2.固定

  目的是殺死細菌，凝固細菌蛋白及結構，便于染色;促使細菌粘附在載玻片上，避免在水洗過(guò)程中被水沖掉;改變細菌對染料的通透性，有利于菌細胞內結構的染色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過(guò)3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。

3.染色

  根據檢驗目的不同，選擇不同的染色方法進(jìn)行染色。染色時(shí)滴加染液，以復蓋標本為度。

4.媒染

  凡能增強染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改變的物質(zhì)，稱(chēng)媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進(jìn)著(zhù)色。媒染劑可用于初染與復染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5.脫色

  凡能使已著(zhù)色的被染物脫去顏色的化學(xué)試劑稱(chēng)為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細菌與染料結合的穩定程度，作為鑒別染色之用。

6.復染

  已脫色處理的細菌或其結構常以復染液作復染以便于觀(guān)察。復染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復染不宜太強，以免掩蓋初染的顏色。

  主要用于厭養菌動(dòng)力的檢查。通常選用60~70mm長(cháng)。0.5~1.0mm孔徑的毛細管虹吸厭養菌懸液后，用火焰將毛細管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野觀(guān)察。

(二)常用染色法

1.單染色法

  只用一種染料染色。由于大多數細菌胞漿內含有酸性物質(zhì)，可與堿性染料結合，故常用呂氏美藍、結晶紫和稀釋石碳酸復紅等染液。此法可觀(guān)察細菌的大小、形態(tài)與排列，不能顯示細菌的結構與染色特性。

2.復染色法

  用兩種或兩種以上不同染料可將細菌染成不同的顏色，除可觀(guān)察細菌的大小、形態(tài)與排列外，還反應出細菌染色特性，具有鑒別細菌種類(lèi)的價(jià)值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。

  (1)革蘭染色：①細菌涂片經(jīng)火焰固定，加結晶紫染液染1min，清水沖去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動(dòng)約30s，至無(wú)紫色洗落為止，水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復紅或沙黃染液數滴進(jìn)行復染，約30s，水洗。⑤干后顯微鏡下鏡檢觀(guān)察結果，革蘭陽(yáng)性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。

  (2)抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：①細菌涂片經(jīng)火焰固定，加石炭酸復紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現，切不可沸騰。染液因蒸發(fā)減少時(shí)，應隨時(shí)補充，防止染液蒸干。持續染5min(奴卡菌需要加長(cháng)時(shí)間)，水洗，甩干。②滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時(shí)搖動(dòng)玻片至無(wú)紅色脫落為止，水洗，甩干。③加呂氏美藍復染液數滴復染1min，水洗。④干后顯微鏡下鏡檢觀(guān)察結果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。

  金胺O-羅丹明B染色法：①細菌涂片固定后加第1液30~90s。②棄去第1液后加第2液染15min。③用第3液脫色1~2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀(guān)察結果 在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細菌和細胞呈藍色。

3.特殊染色法

  (1)鞭毛染色(改良Ryu法)：①玻片的處理 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時(shí)取出，以干凈紗布擦干。②在玻片上滴蒸餾水1滴。③挑取培養物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細菌進(jìn)入水滴，不可攪動(dòng)，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min輕輕水洗。⑤干后顯微鏡鏡檢觀(guān)察結果 鞭毛和菌體呈紫色。

  (2)異染顆粒染色(阿爾培托法)：①細菌涂片經(jīng)火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。②滴加乙液，染1min。水洗。③干后顯微鏡鏡檢觀(guān)察結果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。

  (3)莢膜染色：①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，持續3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液;第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍色或不著(zhù)色。

  (4)芽胞染色：染液：第一液為萋-納氏石炭酸復紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍液。方法：將已固定的細菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復染1min，水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈藍色，芽胞呈紅色。

4.負染色法

  背景著(zhù)色而菌體本身不著(zhù)色的染色為負染色法。最常見(jiàn)的是墨汁負染色法，用來(lái)觀(guān)察真菌及細菌莢膜等。在標本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產(chǎn)生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細胞，轉高倍鏡或油鏡確認，如新型隱球菌可見(jiàn)寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。

5.熒光染色法

  經(jīng)熒光素染色的細菌，或熒光素標記的熒光抗體與相應抗原的細菌、病毒結合形成的復合物，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。

微生物培養與分離方法

  大多數細菌均可以通過(guò)人工方法培養，而衣原體和病毒的分離培養往往需要活組織、雞胚、特殊細胞株及動(dòng)物接種。只有將微生物培養出來(lái)才能對它進(jìn)行研究、鑒定和應用。

一、接種與分離方法

  根據待檢標本的性質(zhì)、培養目的和所用培養基的種類(lèi)，采用不同的接種方法。

1.平板劃線(xiàn)分離培養法

  對混有多種細菌的臨床標本，采用劃線(xiàn)分離和培養，使原來(lái)混雜在一起的細菌沿劃線(xiàn)在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個(gè)菌落，以獲得純種。臨床送檢的標本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細菌檢驗均需要借助瓊脂平板劃線(xiàn)分離目的菌。平板劃線(xiàn)分離法通常有兩種方法：

  (1)分區劃線(xiàn)分離法：此法常用于含菌量較多的標本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細菌的分離。先用接種環(huán)挑取標本涂布于瓊脂平板1區(占培養基總面積的?)并作數條劃線(xiàn)，再于2、3、4區依次劃線(xiàn)。每劃完一個(gè)區域，均將接種環(huán)燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區域，每一區域的劃線(xiàn)均與上一區域的劃線(xiàn)交接1~3次。一個(gè)成功分區劃線(xiàn)的平板，培養后分別觀(guān)察1區形成菌苔，2區菌落連成線(xiàn)，3區和4區可分離到單個(gè)菌落。

  (2)連續劃線(xiàn)分離法：此法常用于含菌量不多的標本或培養物中的細菌分離培養。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹，然后再用接種環(huán)或拭子在平板表面曲線(xiàn)連續劃線(xiàn)接種，直至劃滿(mǎn)瓊脂平板表面。

2.瓊脂斜面接種法

  主要用于菌落的移種，以獲得純種進(jìn)行鑒定和保存菌種等。用接種環(huán)(針)挑取單個(gè)菌落或培養物，從培養基斜面底部向上劃一條直線(xiàn)，然后再從底部沿直線(xiàn)向上曲折連續劃線(xiàn)，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線(xiàn)接種。

3.穿刺接種法

  此法多用于半固體培養基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養基接種，半固體培養基的穿刺接種可用于觀(guān)察細菌的動(dòng)力。接種時(shí)用接種針挑取菌落，由培養基中央垂直刺入至距管底0.4cm處，再沿穿刺線(xiàn)退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線(xiàn)接種斜面部分。

4.液體培養基接種法

  用于各種液體培養基如肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，傾斜液體培養管，在液面與管壁交界處研磨接種物(以試管直立后液體淹沒(méi)接種物為準)。此接種法應避免接種環(huán)與液體過(guò)多接觸，更不應在液體中混勻、攪拌，以免形成氣溶膠，造成實(shí)驗室污染。

5.傾注平板法

  本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標本中的細菌計數。取純培養物的稀釋或原標本1ml至無(wú)菌培養皿內，再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養基15~20ml傾注入該無(wú)菌培養皿內，混勻，待凝固后置37℃培養，長(cháng)出菌落后進(jìn)行菌落計數，以求出每毫升標本中所含菌數。先數6個(gè)方格(每格為1cm2)中菌落數，求出每格的平均菌落數，并算出平皿直徑，然后按下列公式計數，求出每毫升標本中的細菌數。

  全平板菌落數=每方格的平均菌落數×лr2

  每ml標本中的細菌數=全平板菌落數×稀釋倍數

6.涂布接種法

  本法多用于紙片擴散法藥敏試驗的細菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養，本法經(jīng)培養后細菌形成菌苔。

二、細菌的培養方法

  根據不同的標本及不同的培養目的，可選用不同的培養方法。通常把細菌的培養方法分為需氧培養、二氧化碳培養、微需氧培養和厭氧培養四種。

1.需氧培養

  是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養，將已接種好的平板、斜面、液體培養基等在空氣中置35℃孵育箱內孵育18~24h，無(wú)特殊要求的細菌均可生長(cháng)。少數生長(cháng)緩慢的細菌需要培養3-7d甚至1個(gè)月才能生長(cháng)。為使孵育箱內保持一定的濕度，可在其內放置一杯水。對培養時(shí)間較長(cháng)的培養基，接種后應將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固，以防培養基干裂。

2.二氧化碳培養

  某些細菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培養，特別是在初次分離時(shí)，須在5%~10 %二氧化碳環(huán)境中培養才能生長(cháng)。常用的培養法如下。

  (1)二氧化碳培養箱法：二氧化碳孵箱能自動(dòng)調節二氧化碳的含量、溫度和濕度，培養物置于孵育箱內閣，孵育一定時(shí)間后可直接觀(guān)察生長(cháng)結果。

  (2)燭缸培養法：取有蓋磨口標本缸或玻璃干燥器，將接種好的培養基放入缸內，點(diǎn)燃蠟燭后放在缸內稍高于培養物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內蠟燭燃燒氧逐漸減少，數分鐘后蠟燭自行熄滅，此時(shí)容器內二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置于35℃普通孵育箱內孵育。

  (3)氣袋法：選用無(wú)毒透明的塑料袋，將已接種標本的培養皿放入袋內，盡量祛除袋內空氣后將開(kāi)口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態(tài)，執斷袋內已置的二氧化碳產(chǎn)氣管(安瓿)產(chǎn)生二氧化碳，數分鐘內就可達到需要的二氧化碳培養環(huán)境，置于35℃孵育箱內孵育。

  (4)化學(xué)法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱(chēng)取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例，分別置容器內，連同容器置于玻璃缸內，蓋緊密封，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。于35℃孵育箱內孵育。

3.微需氧培養

  微需氧菌培養在大氣中及絕對無(wú)氧環(huán)境中均不能生長(cháng)，在含有5%-6% 氧氣，5%-10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環(huán)境中才可生長(cháng)，將標本接種到培養基上，置于上述氣體環(huán)境中，35℃進(jìn)行培養即微需氧培養法。

4.厭氧培養

  厭氧菌對氧敏感，培養過(guò)程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環(huán)境。厭氧培養常用的方法有：物理法、化學(xué)法、生物法。如厭氧罐培養法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。

三、細菌在培養基上生長(cháng)特性

1.固體培養基

  標本或液體培養物劃線(xiàn)接種到固體培養基表面后，單個(gè)細菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的細菌集團，稱(chēng)為菌落(colony)。

  (1)菌落的形態(tài)特征：大小、形狀(露滴狀、圓形、菜花樣、不規則等)、突起或扁平、凹陷、邊緣(光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等)、顏色(紅色、灰白色、黑色、綠色、無(wú)色、黃色等)、表面(光滑、粗糙等)、透明度(不透明、半透明、透明等)和粘度等。據細菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型： ①光滑型菌落(S型菌落)：菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊，新分離的細菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落(R型菌落)：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質(zhì)形成。R型細菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細菌弱。但也有少數細菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結核分枝菌等。③粘液型菌落(M型菌落)：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見(jiàn)于厚莢膜或豐富粘液層的細菌、結核桿菌等。

  (2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。①α溶血：又稱(chēng)草綠色溶血，菌落周?chē)囵B基出現1~2mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致;②β溶血：又稱(chēng)完全溶血，菌落周?chē)纬梢粋€(gè)完全清晰透明的溶血環(huán)，是細菌產(chǎn)生的溶血素使紅細胞完全溶解所致;③γ溶血：即不溶血，菌落周?chē)?span style="\"color:" rgb(0,="" 0,="" 255);\"="">培養基沒(méi)有變化，紅細胞沒(méi)有溶解或缺損。(3)色素：有些細菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周?chē)呐囵B基出現綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。

  (4)氣味：某些細菌在培養基中生長(cháng)繁殖后可產(chǎn)生特殊氣味，如銅綠假單胞菌(生姜氣味)、變形桿菌(巧克力燒焦的臭味)、厭氧梭菌(腐敗的惡臭味)、白色假絲酵母菌(酵母味)和放線(xiàn)菌(泥土味)等。

2.液體培養基

  細菌在液體培養基中有3種生長(cháng)現象：大多數細菌在液體培養基生長(cháng)繁殖后呈均勻混濁;少數鏈狀排列的細菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長(cháng);枯草芽胞桿菌、結核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專(zhuān)性需氧菌一般呈表面生長(cháng)，常形成菌膜。

3.半固體培養基

  半固體培養基主要用于細菌動(dòng)力試驗，有鞭毛的細菌除了沿穿刺線(xiàn)生長(cháng)外，在穿刺線(xiàn)兩側也可見(jiàn)羽毛狀或云霧狀混濁生長(cháng)。無(wú)鞭毛的細菌只能沿穿刺線(xiàn)呈明顯的線(xiàn)狀生長(cháng)，穿刺線(xiàn)兩邊的培養基仍然澄清透明，為動(dòng)力試驗陰性。