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更新 | GB 4789.9-2014 空腸彎曲菌檢驗及注意事項

發(fā)布時(shí)間：2024-05-27 瀏覽次數：245 分享：

空腸彎曲菌的生物學(xué)特性

生物學(xué)特性：彎曲菌屬是一類(lèi)耐熱微需氧菌，革蘭氏染色陰性。彎曲菌體彎曲如小逗點(diǎn)狀，菌體兩端相接時(shí)呈“S”形、螺旋狀或海鷗展翅狀，菌體一端或兩端有鞭毛，運動(dòng)活潑，無(wú)芽孢。彎曲菌包括17個(gè)種和8個(gè)亞種，引起人類(lèi)感染致病菌的彎曲菌中80%~90%都是空腸彎曲菌。

流行學(xué)特征：空腸彎曲菌廣泛分布于自然界中，是人畜共患致病菌微生物，人類(lèi)感染主要是以食用生的、未徹底加熱的禽肉和消毒不充分的牛奶為主，衛生較差的地區則以水源性傳播多見(jiàn)。臨床表現為急性或自限性腸炎，癥狀和普通腸炎類(lèi)似，20%以上患者會(huì )出現病情復發(fā)或病程延長(cháng)現象，嚴重者會(huì )并發(fā)格林-巴利綜合征。

空腸彎曲菌的檢驗

操作注意事項

1：對易產(chǎn)生較大顆粒的樣品（如肉類(lèi)、貝類(lèi)）進(jìn)行檢測時(shí)，建議使用帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋，以便均質(zhì)后用吸管吸取勻液；
2：檢測含乳制品時(shí)，均質(zhì)后后應檢測pH值。如有必要，用1mol/mL無(wú)菌NaOH或HCl調整pH值到7.5±0.2；
3：馬尿酸鈉水解實(shí)驗和吲哚乙酸酯水解實(shí)驗中，為保證實(shí)驗結果的準確性，需要挑取培養狀態(tài)良好的新鮮菌落，菌量應該足夠大；
4：馬尿酸鈉水解實(shí)驗中，加入茚三酮溶液后，不要震蕩，36℃±1℃水浴或培養箱溫浴10min后及時(shí)觀(guān)察結果，不可放置時(shí)間太長(cháng)，以免干擾結果判讀；

培養基原理解析

1、Bolton肉湯

? 配方中乳白蛋白水解物、動(dòng)物組織酶解物提供碳、氮源；酵母浸膏提供各種維生素；氯化鈉維持均衡的滲透壓；丙酮酸鈉和偏亞硫酸氫鈉能中和培養基的有毒物質(zhì)，也能增強培養基的空氣耐受力；a-酮戊二酸提供生長(cháng)因子，促進(jìn)空腸彎曲菌的生長(cháng)；碳酸鈉提供空腸彎曲菌最有利的酸堿環(huán)境；頭孢派酮和多粘菌素B抑制革蘭氏陰性菌；萬(wàn)古霉素和三甲氧芐胺嘧啶抑制革蘭氏陽(yáng)性菌；兩性霉素B抑制酵母和真菌的生長(cháng)。

2、改良CCD瓊脂
? 配方中肉浸液、動(dòng)物組織酶解物、酪蛋白酶解物提供碳、氮源、維生素、生長(cháng)因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；木炭具有解毒、收集二氧化碳和改變表面張力的作用；去氧膽酸鈉為選擇性抑菌劑；頭孢哌酮可抑制普通腸道菌生長(cháng)、兩性霉素B 抑制酵母和真菌生長(cháng)、利福平可抑制非彎曲菌其他厭氧菌。硫酸亞鐵和丙酮酸鈉有利于空腸彎曲菌的生長(cháng)；瓊脂是培養基的凝固劑。
? mCCD瓊脂平板上的可疑空彎菌落通常為淡灰色，有金屬光澤、潮濕扁平，呈擴散生長(cháng)的傾向。

空腸彎曲菌為灰色菌落

3、Skirrow瓊脂
? 配方中蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏提供碳、氮源、維生素、生長(cháng)因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；丙酮酸鈉、焦亞硫酸鈉、硫酸亞鐵有利于彎曲菌的生長(cháng)。頭孢呱酮可抑制革蘭氏陰性細菌和部分革蘭氏陽(yáng)性菌、兩性霉素B 抑制真菌生長(cháng)、利福平可抑制非彎曲菌其他厭氧菌。瓊脂是培養基的凝固劑。

空腸彎曲菌為灰色濕潤單菌落或沿接種線(xiàn)擴散生長(cháng)

4、哥倫比亞血瓊脂
? 配方中動(dòng)物組織酶解物、淀粉提供碳氮源、維生素和生長(cháng)因子；羊血是細菌生長(cháng)繁殖的良好營(yíng)養物質(zhì)。在45～50℃的基礎培養基中加入血液可以保存血液中某些不耐熱的生長(cháng)因子，同時(shí)血球不被破壞。慶大霉素能抑制腸桿菌科和銅綠假單胞菌的生長(cháng)。

空腸彎曲菌為灰色濕潤沿接種線(xiàn)擴散生長(cháng)菌落

5、氧化酶試驗
? 原理：氧化酶使細胞色素C氧化，氧化型細胞色素C再氧化對苯二胺試劑形成紫色復合物，產(chǎn)生顏色反應。
? 操作：滴加1滴氧化酶試劑到一小塊潔凈濾紙上，用玻棒或接種環(huán)（鉑或塑料）挑取適量新鮮菌苔涂在試劑潤濕的紙片上；30秒內出現藍紫色為陽(yáng)性，延遲反應或無(wú)顏色變化為陰性。

6、過(guò)氧化氫酶試驗
? 具有過(guò)氧化氫酶的細菌，能催化過(guò)氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現氣泡。
? 操作：挑取一環(huán)菌落培養物，加到在干凈顯微鏡玻片上的一滴3％過(guò)氧化氫溶液中，如果在30秒內出現氣泡則判定結果為陽(yáng)性。

過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性

7、馬尿酸鈉水解試驗
? 原理：細菌具有馬尿酸鈉水解酶，可將馬尿酸鈉水解為甘氨酸和苯甲酸，甘氨酸可與茚三酮反應生成紫色化合物。
? 操作：挑取欲檢測的菌落培養物，加到盛有0.4mL 1％的馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液，注意不要帶入培養基瓊脂?；旌暇鶆蚝笤?7℃水浴中溫育2 h或36℃培養箱中溫育4 h。輕輕地在馬尿酸鹽溶液的頂部加入0.2mL茚三酮溶液，不要振蕩，在37℃水浴或36℃培養箱中溫育10 min后判讀結果。若出現黑紫色則為陽(yáng)性；若出現淡紫色或沒(méi)有顏色變化則為陰性。

馬尿酸鈉水解試驗陽(yáng)性

8、吲哚乙酸酯水解試驗
? 挑取欲檢測的菌落培養物，加到羥基吲哚醋酸鹽紙片上面，再滴加一滴滅菌蒸餾水。如果吲哚乙酸脂水解，則在5～10min內出現深藍色；若沒(méi)有顏色變化則表示水解反應沒(méi)有發(fā)生。

吲哚乙酸水解試驗陽(yáng)性

空腸彎曲菌的生化特性

質(zhì)量控制及疑難解析

質(zhì)量控制

1、實(shí)驗室過(guò)程中，每批預增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過(guò)程中是否存在來(lái)自檢驗環(huán)境的污染。

2、定期使用空腸彎曲菌ATCC33291或相應定量活菌參考品，在P2實(shí)驗室或陽(yáng)性對照實(shí)驗室內，用適當的食品樣品進(jìn)行陽(yáng)性實(shí)驗驗證，污染劑量應控制在10-100CFU/25g，并進(jìn)行記錄，驗證實(shí)驗至少每2個(gè)月進(jìn)行1次次。

疑難解析

問(wèn)：空腸彎曲菌在mCCDA瓊脂的形態(tài)是否僅限于正文所述？還有無(wú)其他形態(tài)？
答：空腸彎曲菌在mCCDA瓊脂平板上的形態(tài)與在Skirrow瓊脂平板上相似，但也有可能出現2種形態(tài)，一種為有光澤、潮濕、扁平菌落，呈擴散生長(cháng)的傾向，另一種為分散凸起、有金屬光澤的單個(gè)菌落，直徑約為1~2mm。

問(wèn)：在前增菌或選擇性增菌結束后，肉湯未見(jiàn)微生物生長(cháng)，是否可以終止實(shí)驗?
答：不可以，因為肉湯可見(jiàn)的細菌濃度為10⁷CFU/ml，在此濃度一下，肉眼不能發(fā)現微生物生長(cháng)，但實(shí)際溶液中有微生物生長(cháng)。

所需培養基試劑

用途	貨號	名稱(chēng)	規格
增菌	C-43	圓底立式培養袋	10個(gè)/包
	C-2	2.5L 微需氧產(chǎn)氣劑	10袋/包
	28025	0.1% 蛋白胨水	250g
	27380	Bolton肉湯基礎	250g
	SR0340	Bolton肉湯配套試劑	10支/盒
	CP0570A	Bolton肉湯（含羊血，抗生素）	100mL×6瓶
	CP0571	Bolton肉湯（含羊血，抗生素）	225mL×6瓶
	CP0211	Bolton肉湯（含羊血，抗生素）	10mL×20支
篩選及純化	27382	改良CCD瓊脂基礎	250g/瓶
	SR0320	改良CCD瓊脂基礎配套試劑	10支/盒
	CP0580	改良CCD瓊脂平板	90mm×20/盒
	27385	Skirrow瓊脂基礎	250g/瓶
	SR0330	Skirrow瓊脂配套試劑	10支/盒
	CP0590	Skirrow血瓊脂平板	90mm×20/盒
	29010	革蘭氏染色液	10mL×4瓶
	29170	氧化酶試紙	10片/盒
	24061	哥倫比亞血瓊脂	250g/瓶
	CP0160	哥倫比亞血瓊脂平板	90mm×20/盒
生化鑒定	29161	3%過(guò)氧化氫溶液	2mL×10支
	75770	馬尿酸鹽	20支/盒
	29231	茚三酮試劑	10mL/瓶
	SR0360	吲哚乙酸酯紙片	20片/盒

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