工程院食品安全院士團隊

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一、產(chǎn)氣莢膜梭菌生物學(xué)特性

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)特性

? 生物學(xué)特性：產(chǎn)氣莢膜梭菌屬于厚壁菌門(mén)梭菌狀芽孢桿菌類(lèi)屬，革蘭氏陽(yáng)性粗短大桿菌，有時(shí)可見(jiàn)芽孢體，有莢膜，無(wú)鞭毛，兩端鈍圓，單個(gè)或成雙排列，偶見(jiàn)鏈狀。芽孢橢圓形，位于菌體中央或次級端，芽孢直徑不大于菌體，因能分解肌肉和結締組織中的糖，產(chǎn)生大量氣體，以及本菌在體內能形成莢膜而得名。產(chǎn)氣莢膜梭菌為非專(zhuān)性厭氧菌，在加葡萄糖，血液的普通培養基上生長(cháng)良好。

? 流行學(xué)特征：產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起食源性腸胃炎最常見(jiàn)的病原之一，可引起典型的食物中毒爆發(fā)。產(chǎn)氣莢膜梭菌導致的食物中毒多與肉制品相關(guān)，產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素CPE是引起食物中毒的致病因子。按毒素種類(lèi)，產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E 5個(gè)型，與人類(lèi)致病相關(guān)的為A、C型，其中A型產(chǎn)氣莢膜梭菌是類(lèi)氣性壞疽（外傷感染）和食物中毒的主要病源菌。由于在食品中該菌數量必須達到很高時(shí)（10的7次方或更多），才能在腸道中產(chǎn)生毒素，因此其計數結果是比較關(guān)鍵的。

2、產(chǎn)氣莢膜梭菌的形態(tài)染色

? 產(chǎn)氣莢膜梭菌的典型形態(tài)呈桿狀，直徑0.9～1.3×3 ～ 9μm，常單獨散在，無(wú)鞭毛。

? 革蘭氏染色陽(yáng)性桿菌，有時(shí)可見(jiàn)芽孢體，有莢膜，無(wú)鞭毛，兩端鈍圓，單個(gè)或成雙排列，偶見(jiàn)鏈狀。芽孢橢圓形，位于菌體中央或次級端。

? 芽孢染色菌體紅色，芽孢綠色。

3、產(chǎn)氣莢膜梭菌其他特性

? 在庖肉培養基中培養后使肉湯輕度渾濁，產(chǎn)生大量氣體。

? 非專(zhuān)性厭氧。

? 在血平板上會(huì )出現β溶血環(huán)，并出現雙溶血帶。

? 能發(fā)酵乳糖，葡萄糖，麥芽糖，棉籽糖，不發(fā)酵木糖，鼠李糖。能液化明膠和產(chǎn)生卵磷脂酶（α毒素）。

二、產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗方法

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗流程

2、產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品制備

? 樣品采集后應盡快檢驗，若不能及時(shí)檢驗，可在2 ℃-5 ℃保存；如8 h內不能進(jìn)行檢驗，應以無(wú)菌操作稱(chēng)取25 g（mL）樣品加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應加雙料），并盡快置于-60 ℃ 低溫冰箱中冷凍保存或加干冰保存。

? 冷凍保存及干冰保存操作目的：使待檢樣品保持低氧環(huán)境，防止檢樣中自身微生物的繁殖以及外源微生物的污染。

? 以無(wú)菌操作稱(chēng)取25 g（mL）樣品放入含有225 mL 0.1%蛋白胨水（如為5.1.1 中冷凍保存樣品，室溫解凍后，加入200 mL 0.1%蛋白胨水）的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續均質(zhì)1 min-2 min；或置于盛有225 mL 0.1%蛋白胨水的均質(zhì)杯中，8 000 r/min-10 000 r/min 均質(zhì)1min-2 min，作為1:10 稀釋液。

? 冷凍樣品加200ml稀釋液原因：由于冷凍樣品解凍后重量會(huì )有所增加。    

? 以上述1:10 稀釋液按1 mL 加0.1%蛋白胨水9 mL 制備10^-2到10^-6 的系列稀釋液。   

? 稀釋建議：樣品做梯度稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度要更換吸管，否則會(huì )造成定量結果偏高。

3、產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養

? 吸取各稀釋液1 mL 加入無(wú)菌平皿內，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行。每個(gè)平皿傾注冷卻至50 ℃的TSC瓊脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）15 mL，緩慢旋轉平皿，使稀釋液和瓊脂充分混勻。

? 上述瓊脂平板凝固后，再加10 mL 冷卻至50 ℃的TSC瓊脂（可放置于50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）均勻覆蓋平板表層。待瓊脂凝固后，正置于厭氧培養裝置內，36 ℃±1 ℃培養20 h～24 h。

? 典型的產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC瓊脂平板上為黑色菌落。   

4、培養基原理解析

1）、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂

? 胰胨、大豆大白胨和酵母粉提供氮源、維生素和生長(cháng)因子；葡萄糖和乳糖為可發(fā)酵糖類(lèi)提供碳源；偏亞硫酸氫鈉和檸檬酸鐵銨用于檢測硫化氫的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色；卵黃含有卵磷脂，可檢測某些含卵磷脂酶的梭菌；D-環(huán)絲氨酸抑制非梭菌的細菌；瓊脂是培養基凝固劑。

? 產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落形態(tài)：偏亞硫酸氫鈉和檸檬酸鐵銨可檢測到H₂S，使菌體顏色呈黑色。傾注法能有效避免H₂S因揮發(fā)導致菌落黑色消失。 

TSC瓊脂（產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124，黑色菌落）

2）、產(chǎn)氣莢膜梭菌的純培養

? 從單個(gè)平板上任選5個(gè)（小于5個(gè)全選）黑色菌落，分別接種到FTG培養基， 36 ℃±1 ℃培養18h～24 h。

? FTG培養基培養后狀態(tài)：氧化層以下渾濁或者成條狀生長(cháng)。   

3）、產(chǎn)氣莢膜梭菌的確證試驗 — 牛奶暴烈發(fā)酵

? 取生長(cháng)旺盛的FTG 培養液1 mL 接種于含鐵牛乳培養基，在46 ℃±0.5 ℃水浴中培養2 h 后，每小時(shí)觀(guān)察一次有無(wú)“暴烈發(fā)酵”現象，該現象的特點(diǎn)是乳凝結物破碎后快速形成海綿樣物質(zhì)，通常會(huì )上升到培養基表面。5 h 內不發(fā)酵者為陰性。產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)酵乳糖，凝固酪蛋白并大量產(chǎn)氣，呈“暴烈發(fā)酵”現象，但培養基不變黑。

? 產(chǎn)氣莢膜梭菌利用乳糖產(chǎn)酸，使牛奶中酪蛋白凝固，同時(shí)產(chǎn)生大量氣體，將凝固的酪蛋白沖成不規則狀。

? 試驗原理：含鐵牛奶中產(chǎn)酸使酪蛋白凝固，同時(shí)產(chǎn)生大量氣體，將凝固的酪蛋白沖散，并將培養基沖至瓶口處，呈現“爆裂發(fā)酵” 的現象。

? 注意事項：進(jìn)行暴烈牛乳發(fā)酵實(shí)驗時(shí)，含鐵牛乳培養基采用加熱煮沸非高壓滅菌方式，能有效提前暴烈發(fā)酵的時(shí)間。此外接種菌液時(shí)，菌液濃度需較高，并且接種于培養基中下部，不能接種于培養基表面；因暴烈發(fā)酵時(shí)培養基會(huì )上升，因此培養及表面到試管口應留一定空隙，防止實(shí)驗過(guò)程中培養基溢出。

4）、產(chǎn)氣莢膜梭菌的確證試驗 — 動(dòng)力硝酸鹽試驗

? 用接種環(huán)（針）取FTG 培養液穿刺接種緩沖動(dòng)力-硝酸鹽培養基，于36 ℃±1 ℃培養24 h。

? 有動(dòng)力的菌株呈擴散生長(cháng)，無(wú)動(dòng)力的菌株只沿穿刺線(xiàn)生長(cháng)。

? 滴加硝酸鹽試劑甲、乙液以檢查亞硝酸鹽的存在。15 min內出現紅色者，表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；如果不出現顏色變化，則加少許鋅粉，放置10 min，出現紅色者，表明該菌株不能還原硝酸鹽。如果沒(méi)有出現顏色，說(shuō)明原菌已經(jīng)將硝酸鹽還原至氮氣甚至銨鹽。   

? 產(chǎn)氣莢膜梭菌無(wú)動(dòng)力，可以將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，表層紅色。

產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124

5）、產(chǎn)氣莢膜梭菌的確證試驗 — 乳糖明膠試驗

? 用接種環(huán)（針）取FTG 培養液穿刺接種乳糖-明膠培養基，于36 ℃±1 ℃培養24 h，觀(guān)察結果。

? 如發(fā)現產(chǎn)氣和培養基由紅變黃，表明乳糖被發(fā)酵并產(chǎn)酸。

? 典型的產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC瓊脂平板上為黑色菌落。

? 將試管于5 ℃左右放置1 h，檢查明膠液化情況。如果培養基是固態(tài)，于36 ℃±1 ℃再培養24 h，重復檢查明膠是否液化。   

? 產(chǎn)氣莢膜梭菌能發(fā)酵乳糖，使明膠液化。   

? 注意事項：穿刺乳糖明膠應注意多次穿刺，保證接種量適宜。

5、產(chǎn)氣莢膜梭菌的計算方法

? 吸取各稀釋液1 mL 加入無(wú)菌平皿內，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行。每個(gè)平皿傾注冷選取典型菌落數在20 CFU～200 CFU 之間的平板，計數典型菌落數。如果：

a）只有一個(gè)稀釋度平板的典型菌落數在20CFU～200CFU 之間，計數該稀釋度平板上的典型菌落；

b）最低稀釋度平板的典型菌落數均小于20 CFU，計數該稀釋度平板上的典型菌落；

c）某一稀釋度平板的典型菌落數均大于200 CFU，但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

d）某一稀釋度平板的典型菌落數均大于200 CFU，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落數不在20 CFU～200 CFU 之間，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

e）2 個(gè)連續稀釋度平板的典型菌落數均在20CFU～200CFU 之間，分別計數2 個(gè)稀釋度平板上的典型菌落。

T --- 樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數; A --- 單個(gè)平板上的典型菌落的總數; B --- 單個(gè)平板上的鑒定為陽(yáng)性的菌落數; C --- 單個(gè)平板上的用于鑒定試驗的菌落數; n1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數)經(jīng)確證試驗有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個(gè)數; n2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數)經(jīng)確證試驗有產(chǎn)氣莢膜梭菌的平板個(gè)數; 0.1 --- 稀釋系數; d --- 稀釋因子(第一稀釋度)。

6、產(chǎn)氣莢膜梭菌的計算示例

T=183×3/5 + 176×4/5+21×4/5 +27×2/5 / { (2 +0.1×2 )0.1 } = 6322

7、產(chǎn)氣莢膜梭菌的結果報告

? 根據TSC瓊脂平板上產(chǎn)氣莢膜梭菌的典型菌落數，按照6.2 中公式計算，報告每g（mL）樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌數，報告單位以CFU/ g（mL）表示；

? 如T 值為0，則以小于1 乘以最低稀釋倍數報告。   

8、產(chǎn)氣莢膜梭菌恒溫熒光核酸快速檢測法