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單核細胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性

生物學(xué)特性：單核細胞增生李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，營(yíng)養需求不高，兼性厭氧。該菌觸酶陽(yáng)性，有動(dòng)力，具有溶血反應、能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖和七葉苷，不能發(fā)酵甘露醇和木糖，MR-VP陽(yáng)性。

流行學(xué)特征：單核細胞增生李斯特菌是一種人畜共患病原菌，它的臨床癥狀為菌血癥、腦膜炎及導致孕婦流產(chǎn)。單核細胞增生李斯特菌廣泛分布存在于自然界，可以加熱殺死，但是對高濃度鹽和酸相對不敏感。它還能在冰箱溫度和真空包裝內增殖，特別有風(fēng)險的材料包括生或加工肉類(lèi)、生牛奶產(chǎn)品、生或熏魚(yú)、預制沙拉和長(cháng)期真空儲存的包裝食物。

單核細胞增生李斯特氏菌的國標檢驗方法

操作注意事項

1：對易產(chǎn)生較大顆粒的樣品（如肉類(lèi)）進(jìn)行檢測時(shí)，建議使用帶濾網(wǎng)均質(zhì)袋，以便均質(zhì)后用吸管吸取勻液；
2：預增菌時(shí)間與樣品種類(lèi)、目標菌和雜菌的含量及狀態(tài)等因素有關(guān)。一般菌相比較復雜的高污染樣品，如果增菌時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致雜菌生長(cháng)過(guò)多，目標菌可能就會(huì )被另一種優(yōu)勢菌所取代，這種情況下，增菌時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。低污染樣品的增菌時(shí)間可以適當延長(cháng)。由于本標準適用的樣品種類(lèi)眾多，預增菌的時(shí)間應根據實(shí)際情況和經(jīng)驗進(jìn)行具體選擇。建議增菌液發(fā)生混濁時(shí)停止預增菌。
3：分離劃線(xiàn)用直徑3mm的接種環(huán)（1環(huán)約10微升）。
4：動(dòng)力試驗的培養溫度不能超過(guò)30℃。

操作難點(diǎn)1-可疑菌落的識別

1）PALCAM培養基

可疑菌落特征：在PALCAM 瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落,周?chē)凶睾谏馊?，有些菌落有黑色凹陷?/p>

疑點(diǎn)：單核細胞增生李斯特氏菌與屬內其他李斯特氏菌菌落特征無(wú)明顯差別，可疑菌落多，后續確證工作量大。

2）CRM014 李斯特氏菌顯色培養基

可疑菌落特征：單核細胞增生李斯特氏菌形成藍綠色規測光滑的小菌落，周?chē)腥榘咨境恋憝h(huán)；其他李斯特氏菌為藍綠色無(wú)暈圈菌落；雜菌被抑制或顯示其他顏色。

疑點(diǎn)：乳白色脂肪沉淀環(huán)擴散覆蓋其他菌落時(shí)極易引起假陽(yáng)性。

操作難點(diǎn)一的解決方案：

1）CRM013 單增李斯特氏菌顯色培養基

可疑菌落特征：?jiǎn)魏思毎錾钏固厥暇纬伤{綠色規測光滑的小菌落；其他李斯特氏菌為無(wú)色菌落；雜菌被抑制或顯示其他顏色。

李斯特氏菌顯色培養基與單增李斯特氏菌顯色培養基的對比

CRM013 單增李斯特氏菌顯色培養基的優(yōu)勢

配制簡(jiǎn)便：添加劑易溶，克服李斯特氏菌顯色培養基配制不當所致暈圈特征不明顯問(wèn)題，同時(shí)節省了時(shí)間和減少了勞動(dòng)強度。
特異性極強：對于陰性菌有著(zhù)很好的抑制作用；對于有害李斯特菌和無(wú)害李斯特菌，有著(zhù)很好的分辨能力和靈敏度；
結果易讀：顏色清晰易辯，結果一目了然；
準確率高：能避免假陽(yáng)性及假陰性結果。

操作難點(diǎn)二：可疑菌落鑒定

1）革蘭氏染色鏡檢：李斯特氏菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌。

2）動(dòng)力試驗：李斯特氏菌有動(dòng)力,在半固體或SIM培養基上方呈傘狀生長(cháng),如傘狀生長(cháng)不明顯,可繼續培養5再觀(guān)察結果

3）過(guò)氧化氫酶試驗：李斯特氏菌過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性反應

4）傳統生化試驗：七葉苷、甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖磷酸鹽胨水（MR/VP）

5）溶血試驗：單增李斯特氏菌呈現狹窄、清晰、明亮的溶血圈；斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周?chē)a(chǎn)生弱的透明溶血圈；英諾克李斯特氏菌無(wú)溶血圈；伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區域。若結果不明顯，可置4℃冰箱24h~48h再觀(guān)察。

注意事項：穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂，36 ℃±1 ℃培養24h~48h，于明亮處觀(guān)察。

6）協(xié)同溶血試驗cAMP（可選做項目）

實(shí)驗操作：在血瓊脂平板上平行劃線(xiàn)接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養的單個(gè)可疑菌落垂直劃線(xiàn)接種于平行線(xiàn)之間，垂直線(xiàn)兩端不要觸及平行線(xiàn)，距離1~2mm，于36℃±1℃培養24h~48h。

結果判讀：單核細胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現約2mm 的β-溶血增強區域，斯氏李斯特氏菌也出現微弱的溶血增強區域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現約5mm~10mm 的“箭頭狀”β-溶血增強區域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現象。若結果不明顯，可置4 ℃冰箱24h~48h再觀(guān)察。

操作難點(diǎn)二解決方案：

1）MID67李斯特氏菌鑒定系統

MID67 李斯特菌鑒定系統優(yōu)點(diǎn)

MID67 中的溶血試驗反應，可替代傳統的血平板溶血試驗和CAMP

MID67  李斯特菌鑒定系統使用流程

最后將數值編碼輸入MID數據庫中檢索，即可獲得鑒定結果。

2）單核細胞增生李斯特氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR快檢法

產(chǎn)品：?jiǎn)魏思毎錾钏固厥暇鷮?shí)時(shí)熒光PCR擴增試劑盒

技術(shù)原理：基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，針對檢測目標特異性基因片段設計引物和熒光探針并優(yōu)化反應所需試劑組分，加入待檢樣品核酸即可進(jìn)行擴增反應。在擴增過(guò)程中，熒光探針與目的基因片段結合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時(shí)熒光定量PCR儀可識別該熒光信號，同時(shí)根據其強弱變化繪制出相應的實(shí)時(shí)擴增曲線(xiàn)，進(jìn)而判定目標基因是否檢出。

產(chǎn)品優(yōu)勢：快速提取，一步法核酸提取，快速高效，核酸提取效率高；  操作簡(jiǎn)單，提供PCR反應體系預混液，直接加樣檢測，無(wú)需自行配制；  特異性強，采用高特異性引物及探針，確保實(shí)驗準確性；  靈敏度高，采用高效的擴增酶，檢測靈敏度可達10-100copies/test。

產(chǎn)品組成：

質(zhì)量控制及疑難解析

一，質(zhì)量控制

1： 實(shí)驗室過(guò)程中，每批預增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過(guò)程中是否存在來(lái)自檢驗環(huán)境的污染。
2： 定期使用單核細胞增生李斯特氏菌ATCC19115菌種或等效的其他標準株，在P2實(shí)驗室或陽(yáng)性對照實(shí)驗室內，用適當的食品樣品進(jìn)行陽(yáng)性對照實(shí)驗驗證，污染劑量應控制在10-100CFU/25g，并進(jìn)行記錄，驗證實(shí)驗至少每2個(gè)月進(jìn)行1次。
3：要求對使用的培養基和生化試劑每批均用GB4789.30-2016推薦的陽(yáng)性和陰性對照標準菌種進(jìn)行驗證，并做好記錄。

二，疑難解析

Q1： 為什么在沒(méi)有典型菌落時(shí)仍要挑取非典型菌落進(jìn)行鑒定？
根據經(jīng)驗，有少數單核細胞增生李斯特氏菌在李斯特顯色平板上呈現非典型菌落。
Q2：為什么在PALCAM選擇性平板上挑取典型菌落，鑒定后非單核細胞增生李斯特菌的概率較高？
PALCAM是李斯特菌屬的選擇性平板，根據經(jīng)驗，環(huán)境存在較多的英諾克李斯特菌，應結合顯色平板，挑取較多的典型菌落鑒定。
Q3：當3個(gè)及以上連續稀釋度的結果均為陽(yáng)性時(shí)，如何選擇？
選擇原則參考Bacteriological Analytical Mannual Appendix 2: Most Probable Number form Serial Dilutions。
Q4：如果前增菌或選擇性增菌結束后，肉湯中未見(jiàn)微生物生長(cháng)，是否可以終止實(shí)驗？

不可以，因為肉眼可見(jiàn)的細菌濃度為107CFU/mL，在此濃度以下，肉眼是不能發(fā)現。

所需培養基試劑