工程院食品安全院士團隊

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一、菌落總數定義和衛生學(xué)意義

?菌落總數定義：指在一定條件下（如需氧情況、營(yíng)養條件、pH、培養溫度和時(shí)間等）每克（每毫升）檢樣所生長(cháng)出來(lái)的菌落數

?衛生學(xué)意義：菌落總數測定是用來(lái)判定食品被細菌污染的程度及衛生質(zhì)量，它反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛生要求，以便對被檢樣品做出適當的衛生學(xué)評價(jià)。菌落總數的多少在一定程度上標志著(zhù)食品衛生質(zhì)量的優(yōu)劣。

二、新標準概況

2022年06月30日發(fā)布     2022年12月30日實(shí)施

本標準與ＧＢ４７８９.２—２０１６相比，主要變化如下： —— 增加了附錄Ｂ(菌落總數結果不同情況計算方法示例)； —— 修改了設備和材料； —— 修改了培養基和試劑； —— 修改了檢驗程序； —— 修改了操作步驟； —— 修改了附錄 Ａ（pca配方標注主要營(yíng)養成分）。

三、修訂亮點(diǎn)

修訂亮點(diǎn):“增加菌落總數測試片”

四、HandyPlate測試片的質(zhì)量控制

HandyPlate測試片質(zhì)量控制標準依據

?GB4789.28-2013 食品微生物學(xué)檢驗 培養基和試劑的質(zhì)量要求

測試片使用步驟：
1、制備適宜濃度的測試菌液(可按GB4789.28自己制備，也可采用商品的定量菌株）

2、取1ml接種待測試測試菌片，另取1ml測試菌液傾注參比培養基TSA，按GB4789.28-2013附錄D中平板計數瓊脂（PCA）對應的質(zhì)量控制標準上的培養條件進(jìn)行。

3、計數待測測試片上和參比培養基TSA上的菌落數（下圖為測試菌大腸埃希氏菌ATCC25922在菌落總數測試片和參比培養基上生長(cháng)的結果）

選擇菌落數適中的平板進(jìn)行計數，按下列式（1）計算生長(cháng)率。

式中：
PR——生長(cháng)率；
NS——待測培養基平板上得到的菌落總數；
N0——參比培養基平板上獲得的菌落總數。
參比培養基的選擇：一般細菌采用TSA，一般霉菌和酵母采用沙氏葡萄糖瓊脂，對營(yíng)養有特殊要求的微生物采用適合其生長(cháng)的不含抑菌劑或抗生素的培養基。
5、結果判定

依據GB4789.28-2013附錄D中平板計數瓊脂（PCA）對應的質(zhì)量控制標準上質(zhì)控評定標準各測試菌的生長(cháng)率≥0.7，如測試的測試片各測試菌生長(cháng)率≥0.7，則報告檢驗合格，否則，為不合格。

五、其他變更情況

其他一般修訂內容：

六、操作流程及注意事項

菌落總數檢驗流程圖

操作注意事項
1：從樣品的均質(zhì)到傾注瓊脂，應在盡快完成，避免影響結果；
2：檢驗所用物品需無(wú)菌和無(wú)殘留的抑菌物質(zhì)；
3：建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，因為磷酸鹽緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化，對細菌具有保護作用；
4：高壓滅菌后，培養基的瓊脂會(huì )分層在底部，應搖勻后使用；
5：在培養箱中倒置培養，為防止中間平皿過(guò)熱，高度不得超過(guò)6個(gè)平皿。測試片堆疊不超20片

七、結果計算

1. 結果計數

?可用肉眼觀(guān)察,必要時(shí)用放大鏡或菌落計數器,記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(colony-formingunits,CFU)表示。 

?選取菌落數在30CFU~300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(cháng)的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數,大于300CFU的可記錄為多不可計。每個(gè)稀釋度的菌落數應采用兩個(gè)平板的平均數。

?其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(cháng)時(shí),則不宜采用,而應以無(wú)片狀菌落生長(cháng)的平板作為該稀釋度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數。

?當平板上出現菌落間無(wú)明顯界線(xiàn)的鏈狀生長(cháng)勢，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計數。

2. 結果計算

?若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數在30~300CFU之間,計算兩個(gè)平板菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每g(mL)樣品中菌落總數結果，示例B1。

?若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300CFU,則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算，示例B3。

?若所有稀釋度的平板菌落數均小于30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算，示例B4。

?若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(cháng),則以小于1乘以最低稀釋倍數計算，示例B5。

?若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU~300CFU 之間,其中一部分小于30CFU 或大于300CFU 時(shí),則以最接近30CFU 或300CFU 的平均菌落數乘以稀釋倍數計算，示例B6。

?若有兩個(gè)連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時(shí),按式(1)計算，示例B2

表1  菌落總數結果計算與報告方式實(shí)例

3. 結果報告

?菌落數小于100CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數報告。

?菌落數大于或等于100CFU 時(shí),第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數字,后面用0代替位數;也可用10的指數形式來(lái)表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數字。 

?若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計數,則報告菌落蔓延。（已刪除）

?若空白對照上有菌落生長(cháng),則此次檢測結果無(wú)效。

?稱(chēng)重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL為單位報告。

八、質(zhì)量控制和疑難解析

1. 樣品處理時(shí)是否需調節pH?

 答：菌落總數大部分細菌都是嗜中性的，在偏酸偏堿的環(huán)境中都不適宜生長(cháng)，如果樣品本身偏酸或偏堿，那接種后會(huì )改變平板瓊脂培養基的pH，從而影響樣品中大多數微生物的生長(cháng)，影響檢測結果的準確性。

2. 菌落蔓延怎么辦？

 答：首先需分析菌落蔓延的原因，一可能是樣品中含有運動(dòng)性強的細菌如：變形桿菌、芽孢桿菌等，二可能是傾注時(shí)瓊脂培養基溫度高，形成較多冷凝水，三可能是培養時(shí)沒(méi)有倒置，冷凝水滴落所致。

解決辦法：一、注意傾注培養基溫度控制在40-45度之間，避免冷凝水形成；二、培養時(shí)需倒置；三覆蓋一層培養基；四在培養基中添加ttc0.5%，三 、使用菌落總數測試片。

3. 菌落總數計數同一個(gè)稀釋度一個(gè)在計數范圍，一個(gè)不在計數范圍，怎么計？

 答：以在計數范圍的平板菌落數乘以稀釋倍數作為報告結果。例如：某樣品10-1平板菌落數分別320、288，10-2稀釋度平板菌落數26、20，則樣品檢測結果選取288進(jìn)行報告，結果報告為2.9×10的3次方。

4. 平行兩個(gè)板結果相差較大？

 答：可能是樣液未完全混勻，導致菌落分布不均勻；或者取樣偏差較大，注意校準取樣器具和取樣操作細節。平板間、稀釋度間菌落數誤差率不宜超10%。

5. 低稀釋度平板菌落數少于高稀釋度平板菌落數的原因是？

 答：一產(chǎn)品中含防腐劑或抑菌成分，二產(chǎn)品偏酸或偏堿。

6. 做菌落總數檢測時(shí)，沒(méi)有菌落是怎么回事？

 答：一可能是樣品經(jīng)過(guò)滅菌處理，本身就沒(méi)有菌；二是檢測選擇的稀釋度過(guò)高；三樣品含抑菌成分未做去干擾處理；四傾注培養基溫度高或者培養條件不適宜等等。

7. 菌落總數的單位CFU與個(gè)有什么區別？

 答：CFU是菌落形成單位，單不等于細菌個(gè)數，如兩個(gè)相同的細菌細胞連在一起，那經(jīng)過(guò)培養后這兩個(gè)細菌細胞將會(huì )形成一個(gè)菌落。

8. 如何保證檢測結果的有效性？

 答：一檢測過(guò)程需做空白對照，避免外源污染物影響；二檢驗用培養基使用前需進(jìn)行質(zhì)量確認；三檢驗過(guò)程所用器具經(jīng)檢定，操作規范減少誤差。

Q-Strain定量質(zhì)控菌株

九、所需培養基試劑和質(zhì)控菌株

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