一、菌落總數定義和衛生學(xué)意義
?菌落總數定義:指在一定條件下(如需氧情況、營(yíng)養條件、pH、培養溫度和時(shí)間等)每克(每毫升)檢樣所生長(cháng)出來(lái)的菌落數
?衛生學(xué)意義:菌落總數測定是用來(lái)判定食品被細菌污染的程度及衛生質(zhì)量,它反映食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛生要求,以便對被檢樣品做出適當的衛生學(xué)評價(jià)。菌落總數的多少在一定程度上標志著(zhù)食品衛生質(zhì)量的優(yōu)劣。
二、新標準概況
2022年06月30日發(fā)布 2022年12月30日實(shí)施
本標準與GB4789.2—2016相比,主要變化如下: —— 增加了附錄B(菌落總數結果不同情況計算方法示例); —— 修改了設備和材料; —— 修改了培養基和試劑; —— 修改了檢驗程序; —— 修改了操作步驟; —— 修改了附錄 A(pca配方標注主要營(yíng)養成分)。 |
三、修訂亮點(diǎn)
修訂亮點(diǎn):“增加菌落總數測試片”
四、HandyPlate測試片的質(zhì)量控制
HandyPlate測試片質(zhì)量控制標準依據
?GB4789.28-2013 食品微生物學(xué)檢驗 培養基和試劑的質(zhì)量要求
測試片使用步驟:
1、制備適宜濃度的測試菌液(可按GB4789.28自己制備,也可采用商品的定量菌株)
2、取1ml接種待測試測試菌片,另取1ml測試菌液傾注參比培養基TSA,按GB4789.28-2013附錄D中平板計數瓊脂(PCA)對應的質(zhì)量控制標準上的培養條件進(jìn)行。
3、計數待測測試片上和參比培養基TSA上的菌落數(下圖為測試菌大腸埃希氏菌ATCC25922在菌落總數測試片和參比培養基上生長(cháng)的結果)
選擇菌落數適中的平板進(jìn)行計數,按下列式(1)計算生長(cháng)率。
式中:
PR——生長(cháng)率;
NS——待測培養基平板上得到的菌落總數;
N0——參比培養基平板上獲得的菌落總數。
參比培養基的選擇:一般細菌采用TSA,一般霉菌和酵母采用沙氏葡萄糖瓊脂,對營(yíng)養有特殊要求的微生物采用適合其生長(cháng)的不含抑菌劑或抗生素的培養基。
5、結果判定
依據GB4789.28-2013附錄D中平板計數瓊脂(PCA)對應的質(zhì)量控制標準上質(zhì)控評定標準各測試菌的生長(cháng)率≥0.7,如測試的測試片各測試菌生長(cháng)率≥0.7,則報告檢驗合格,否則,為不合格。
五、其他變更情況
其他一般修訂內容:
2022版 | 2016版 | |
設備和材料 | 恒溫裝置:48℃±2℃ | 恒溫水浴箱: 46 ℃±1 ℃ |
培養基和試劑 | 4.3 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液 4.4 無(wú)菌生理鹽水 | 4.2 磷酸鹽緩沖液 4.3 生理鹽水 |
檢驗程序/操作步驟 | 6.1.2 液體樣品稀釋補充“或放入盛有225ml稀釋液的無(wú)菌均質(zhì) 袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1:10的樣品勻液” 6.1.5選擇1~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液,各取1mL分別加入無(wú)菌培養皿內 6.1.6 及時(shí)將15mL~20mL冷卻至46℃~50℃的平板計數瓊脂培養基(可放置于48℃±2℃恒溫 裝置中保溫)傾注培養皿,并轉動(dòng)培養皿使其混合均勻。 | / 2-3個(gè)適宜稀釋度 及時(shí)將15mL~20mL冷卻至46 ℃的平板計數瓊脂培養基(可放置于46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱 中保溫)傾注平皿,并轉動(dòng)平皿使其混合均勻。 |
菌落計數 | / | 每個(gè)稀釋度的菌落數應采用兩個(gè)平板的 平均數。 |
菌落總數的報告 | / | 若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計數,則報告菌落蔓延 |
附錄B | 新增:菌落總數結果不同情況計算方法示例” | / |
六、操作流程及注意事項
菌落總數檢驗流程圖
操作注意事項
1:從樣品的均質(zhì)到傾注瓊脂,應在盡快完成,避免影響結果;
2:檢驗所用物品需無(wú)菌和無(wú)殘留的抑菌物質(zhì);
3:建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液,因為磷酸鹽緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化,對細菌具有保護作用;
4:高壓滅菌后,培養基的瓊脂會(huì )分層在底部,應搖勻后使用;
5:在培養箱中倒置培養,為防止中間平皿過(guò)熱,高度不得超過(guò)6個(gè)平皿。測試片堆疊不超20片
七、結果計算
1. 結果計數
?可用肉眼觀(guān)察,必要時(shí)用放大鏡或菌落計數器,記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(colony-formingunits,CFU)表示。
?選取菌落數在30CFU~300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(cháng)的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數,大于300CFU的可記錄為多不可計。每個(gè)稀釋度的菌落數應采用兩個(gè)平板的平均數。
?其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(cháng)時(shí),則不宜采用,而應以無(wú)片狀菌落生長(cháng)的平板作為該稀釋度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數。
?當平板上出現菌落間無(wú)明顯界線(xiàn)的鏈狀生長(cháng)勢,則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計數。
2. 結果計算
?若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數在30~300CFU之間,計算兩個(gè)平板菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每g(mL)樣品中菌落總數結果,示例B1。
?若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300CFU,則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算,示例B3。
?若所有稀釋度的平板菌落數均小于30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算,示例B4。
?若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(cháng),則以小于1乘以最低稀釋倍數計算,示例B5。
?若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU~300CFU 之間,其中一部分小于30CFU 或大于300CFU 時(shí),則以最接近30CFU 或300CFU 的平均菌落數乘以稀釋倍數計算,示例B6。
?若有兩個(gè)連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時(shí),按式(1)計算,示例B2
表1 菌落總數結果計算與報告方式實(shí)例
編號 | 稀釋倍數及菌落數 | |||||||
10-1 | 10-2 | 10-3 | 菌落總數 | 報告方式 | ||||
平皿1 | 平皿2 | 平皿1 | 平皿2 | 平皿1 | 平皿2 | (CFU/g或ml) | (CFU/g或ml) | |
1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ﹤1×10 | ﹤10 |
2 | 24 | 26 | 5 | 7 | 0 | 0 | 250 | 250或2.5×102 |
3 | 多不可計 | 多不可計 | 150 | 160 | 15 | 20 | 15500 | 16000或1.6×104 |
4 | 多不可計 | 多不可計 | 236 | 245 | 35 | 33 | 24955 | 25000或2.5×104 |
5 | 多不可計 | 多不可計 | 236 | 245 | 25 | 33 | 24476 | 24000或2.4×104 |
6 | 多不可計 | 多不可計 | 多不可計 | 多不可計 | 320 | 330 | 325000 | 330000或3.3×105 |
7 | 多不可計 | 多不可計 | 310 | 320 | 28 | 26 | 27000 | 27000或2.7×104 |
8 | 多不可計 | 多不可計 | 295 | 325 | 22 | 20 | 29500 | 30000或3.0×104 |
9 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 | 菌落蔓延 |
3. 結果報告
?菌落數小于100CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數報告。
?菌落數大于或等于100CFU 時(shí),第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數字,后面用0代替位數;也可用10的指數形式來(lái)表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數字。
?若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計數,則報告菌落蔓延。(已刪除)
?若空白對照上有菌落生長(cháng),則此次檢測結果無(wú)效。
?稱(chēng)重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL為單位報告。
八、質(zhì)量控制和疑難解析
1. 樣品處理時(shí)是否需調節pH?
答:菌落總數大部分細菌都是嗜中性的,在偏酸偏堿的環(huán)境中都不適宜生長(cháng),如果樣品本身偏酸或偏堿,那接種后會(huì )改變平板瓊脂培養基的pH,從而影響樣品中大多數微生物的生長(cháng),影響檢測結果的準確性。
2. 菌落蔓延怎么辦?
答:首先需分析菌落蔓延的原因,一可能是樣品中含有運動(dòng)性強的細菌如:變形桿菌、芽孢桿菌等,二可能是傾注時(shí)瓊脂培養基溫度高,形成較多冷凝水,三可能是培養時(shí)沒(méi)有倒置,冷凝水滴落所致。
解決辦法:一、注意傾注培養基溫度控制在40-45度之間,避免冷凝水形成;二、培養時(shí)需倒置;三覆蓋一層培養基;四在培養基中添加ttc0.5%,三 、使用菌落總數測試片。
3. 菌落總數計數同一個(gè)稀釋度一個(gè)在計數范圍,一個(gè)不在計數范圍,怎么計?
答:以在計數范圍的平板菌落數乘以稀釋倍數作為報告結果。例如:某樣品10-1平板菌落數分別320、288,10-2稀釋度平板菌落數26、20,則樣品檢測結果選取288進(jìn)行報告,結果報告為2.9×10的3次方。
4. 平行兩個(gè)板結果相差較大?
答:可能是樣液未完全混勻,導致菌落分布不均勻;或者取樣偏差較大,注意校準取樣器具和取樣操作細節。平板間、稀釋度間菌落數誤差率不宜超10%。
5. 低稀釋度平板菌落數少于高稀釋度平板菌落數的原因是?
答:一產(chǎn)品中含防腐劑或抑菌成分,二產(chǎn)品偏酸或偏堿。
6. 做菌落總數檢測時(shí),沒(méi)有菌落是怎么回事?
答:一可能是樣品經(jīng)過(guò)滅菌處理,本身就沒(méi)有菌;二是檢測選擇的稀釋度過(guò)高;三樣品含抑菌成分未做去干擾處理;四傾注培養基溫度高或者培養條件不適宜等等。
7. 菌落總數的單位CFU與個(gè)有什么區別?
答:CFU是菌落形成單位,單不等于細菌個(gè)數,如兩個(gè)相同的細菌細胞連在一起,那經(jīng)過(guò)培養后這兩個(gè)細菌細胞將會(huì )形成一個(gè)菌落。
8. 如何保證檢測結果的有效性?
答:一檢測過(guò)程需做空白對照,避免外源污染物影響;二檢驗用培養基使用前需進(jìn)行質(zhì)量確認;三檢驗過(guò)程所用器具經(jīng)檢定,操作規范減少誤差。
Q-Strain定量質(zhì)控菌株
九、所需培養基試劑和質(zhì)控菌株
用途 | 貨號 | 名稱(chēng) | 規格 |
樣品稀釋 | CP0630 | 生理鹽水 | 盒(袋裝)225 mL×10袋 |
CP0511A | 磷酸鹽緩沖液(PBS) | 盒(瓶裝)225 mL×6瓶 | |
CP0640 | 磷酸鹽緩沖液(PBS) | 盒(袋裝)225 mL×10袋 | |
022117 | 磷酸鹽緩沖液(PBS) | 瓶(干粉)250 g | |
CP0310 | 生理鹽水 | 盒(管裝)9 mL×20支 | |
平板計數 | 022070 | 平板計數瓊脂(PCA) | 瓶(干粉)250 g |
CP0830 | 平板計數瓊脂平板(PCA) | 盒(平板)90 mm×20 | |
022070P1 | 平板計數瓊脂(PCA) | 瓶(顆粒)250 g | |
HANDYPLATE微生物測試片 | HP001 | 菌落總數測試片 | 20片/包 |
Q-Strain定量質(zhì)控菌株 | QS011A | 大腸埃希氏菌(ATCC25922) | 110-1100 CFU/瓶 |
QS011B | 大腸埃希氏菌(ATCC25922) | (0.6-2.0)×107 CFU/瓶 | |
QS008A | 金黃色葡萄球菌(ATCC6538) | 110-1100 CFU/瓶 | |
QS008B | 金黃色葡萄球菌(ATCC6538) | (0.6-2.0)×107 CFU/瓶 | |
QS004A | 枯草芽孢桿菌(CMCC(B) 63501) | 110-1100 CFU/瓶 | |
QS004B | 枯草芽孢桿菌(CMCC(B) 63501) | (0.6-2.0)×107 CFU/瓶 |
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